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本试剂盒使用红细胞裂解液选择性裂解红细胞，然后独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解白细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
  
• 不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 反复优化的红细胞裂解液配方，裂解效果快速完全。
  
• 快速，简捷，单个样品操作一般可在40分钟内完成。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

• 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
  
• 不合适的储存于低温(4℃或-20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下(15～25℃)进行。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
  
• 需要自备乙醇，β-巯基乙醇，一次性注射器，研钵。
  
• 裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
  
• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
    
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
    
  • RNA在裂解液RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水。
    • 将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。
• 关于DNA的微量残留：
  一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，由于本试剂盒采取了百奥莱博独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
  
  • 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
    
  • 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
    
  • 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup)，请联系我们索取具体操作说明书。
    
  • 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
• RNA纯度及浓度检测：
  
  • 完整性： RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
    
  • 纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀读数(10mM Tris,pH7.5)在1.8～2.1之间。OD₂₆₀/OD₂₈₀读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris(pH7.5)溶液中测出的OD₂₆₀/OD₂₈₀读数1.8～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
    
  • 浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD₂₆₀、OD₂₈₀测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μL）= (OD₂₆₀)×(稀释倍数n)×40。

• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
  
• 使用前将10×红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。
  
• 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1mL RLT中加入10μL β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。

• 在适合大小的RNase-free离心管中加入1体积（<1.5mL）加入各种抗凝剂新鲜血液(颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB，颠倒混匀，可轻弹管壁，确保混匀。
  
• 室温放置10分钟。
  
  • 期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞。
    
  • 如果RNA降解严重，可在冰上裂解，但是时间可长一些以充分裂解。
• 12000rpm离心20秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团。
  
  • 离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2、3。
    
  • 上清尽可能的吸弃，残留过多会稀释裂解液，造成裂解结合异常，产量纯度降低。
• 涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬，加入350μL(＜0.5mL全血)或者600μL(0.5～1.5mL全血)裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
  
  • 病人血样中白细胞数量可能大幅增加，应该适当减少处理量。或者按照350μL(＜2×10⁶白细胞)或者600μL(2×10⁶-1×10⁷白细胞)比例加RTL。
• 用带钝针头的一次性1mL(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物5～10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
  
• 较精确估计裂解物体积，加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!)此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
  
• 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中(吸附柱放入收集管中)，13000rpm离心60秒，弃掉废液。
  
• 加700μL去蛋白液RW1，室温放置30秒，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
  • 如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
• 加500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase-free water(事先在70～80℃水浴中加热效果更好)，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
  
• 如果提取全血>0.5mL或者>2×10⁶白细胞，加30～50μL RNase-free water重复步骤11，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
  
  • 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15～30%，但浓度较低，用户根据需要选择。