全血RNA提取试剂盒

产品货号：

ALH015

中文名称：

全血RNA提取试剂盒

英文名称：

Total RNA Extraction Kit From Blood

产品规格：

50次

发货周期：

1～3天

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本试剂盒使用红细胞裂解液选择性裂解红细胞，然后独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解白细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点

离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
反复优化的红细胞裂解液配方，裂解效果快速完全。
快速，简捷，单个样品操作一般可在40分钟内完成。
多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

组分	规格
10×红细胞裂解液RLB	25mL
裂解液RLT	50mL
去蛋白液RW1	25mL
漂洗液RW	10mL
RNase-free H2O	10mL
70%乙醇	9mL
吸附柱和收集管	50套

保存：室温可保存12个月

保存事项

所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
不合适的储存于低温（4℃或者-20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃～25℃）进行。
避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
需要自备乙醇，β-巯基乙醇，一次性注射器，研钵。
裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
预防RNase污染，应注意以下几方面：
- 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
- 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
- RNA在裂解液RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
- 配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
关于DNA的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留，本公司的RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
- 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
- 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
- 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁，请联系我们索取具体操作说明书。
- 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
RNA纯度及浓度检测：
- 完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
- 纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀读数（10mMTris,pH7.5）在1.8～2.1之间。OD₂₆₀/OD₂₈₀读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD₂₆₀/OD₂₈₀读数1.8～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
- 浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD₂₆₀,OD₂₈₀测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD₂₆₀)×(稀释倍数n)×40

提示：

第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。
操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1mL RLT中加入10μL β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。

在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（<1.5mL）加入各种抗凝剂新鲜血液(颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB，颠倒混匀，可轻弹管壁，确保混匀。
室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。如果RNA降解严重，可在冰上裂解，但是时间可长一些以充分裂解。
12000rpm离心20秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2，3。
上清尽可能的吸弃，残留过多会稀释裂解液，造成裂解结合异常，产量纯度降低。
涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬，加入350μL（<0.5mL全血）或者600μL（0.5～1.5mL全血）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。病人血样中白细胞数量可能大幅增加，应该适当减少处理量。或者按照350μL（＜2×10⁶白细胞）或者600μL（2×10⁶-1×10⁷白细胞）比例加RTL。
用带钝针头的一次性1mL(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物5～10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
较精确估计裂解物体积，加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心60秒，弃掉废液。
加700μL去蛋白液RW1，室温放置30秒，12，000rpm离心30秒，弃掉废液。
如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30～50μL RNase free water（事先在70～80℃水浴中加热效果更好），室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
如果提取全血>0.5mL或者>2×10⁶白细胞，加30～50μL RNase free water重复步骤11，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15～30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。

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